Proje Başlığı:
Kisspeptin-GPR54 Sistemi ve Luteinizan Hormonun Alzheimer Hastalığı Patogenezindeki Rollerinin Transgenik Fare Modellerinde Optogenetik ve Farmakogenetik Yöntemlerle Araştırılması
Proje No: 115S327
Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Bayram YILMAZ (Yeditepe Ün. Tıp Fak. Fizyoloji AD)
Araştırmacılar: Prof. Dr. Selim KUTLU
Yrd. Doç. Dr. Burcu Şeker (Yeditepe ün. Tıp Fak. Fizyoloji AD)
Proje Danışmanları: Prof. Dr. Canan Aykut BİNGÖL (Yeditepe ün. Tıp Fak. Nöroloji AD)
Yrd. Doç. Dr. Deniz ATASOY (Medipol Ün. Tıp Fak. Fizyoloji AD)
Proje Süresi: 2015-2018
Proje Bütçesi: 360.000
Proje Özeti:
Alzheimer hastalığı (AH), kognitif fonksiyonlarda sinsi bir bozulmayla başlayan ve izleyen 5-10 yıl içerisinde önemli ölçüde hafıza kaybı, zihin bulanıklığı, davranış ve kişilik değişiklikleri ve konuşma bozukluğuyla seyreden nörodejeneratif bir hastalıktır. En sık görülen demans tipi olan AH tüm dünyada ve ülkemizde giderek artan tıbbi, ekonomik ve sosyal sorunlara neden olmaktadır.
AH, mikroskopik düzeyde β-amyloid plak ve nörofibriler yumak (NFT) oluşumu, oksidatif stres artışı ve hücre döngüsü anormalileri gibi nöropatolojik lezyonlarla karakterizedir. Bu karakteristik plak ve yumakların AH patogenezini başlatan primer patolojik lezyonlar olmaktan çok, nöronal hasar sürecinin sonunda oluşan sekeller olduğu düşünülmektedir. Bu lezyonlar sonuçta birçok beyin bölgesinde ilerleyici nöron, sinaps kaybı ve kognitif fonksiyonların azalmasına neden olmaktadır. Bugün AH’nın yönetilmesi ve terapötik hedefler için ilaç geliştirilmesindeki en önemli zorluk, hastalığın patogenezinin tam olarak anlaşılmamasından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle yeni tedavi stratejileri için arayışlar devam etmektedir.
Luteinizan Hormonun (LH) bu hastalıkta rolü olduğu ileri sürülmüştür. AH’da yüksek LH düzeylerinin baskılanmasının amyloid-β oluşumu üzerinde etkili olabileceği düşünülmektedir. Östrojen replasmanı ile bu hipofizer hormonu kontrol altına almaya yönelik çalışmalar tam olarak istenilen sonuçları vermemiştir. Kisspeptin reseptörü olan GPR54'ün hipokampus ve korteks gibi ekstra-hipotalamik beyin bölgelerinde ifade edildiği gösterilmiştir. GPR54’ün hipokampus ve kortekste de ifade edildiği laboratuvarımızda yapılan pilot deneylerde görülmüştür. Ancak, kisspeptin nöronlarının projeksiyonları araştırılmamıştır. Bu projede kisspeptinin hipokampus ve kortekse projeksiyonları (cre fare teknolojisiyle) ilk defa incelenecektir. Ayrıca, AH’da kisspeptin-GPR54’ün sisteminin olası rolü bugüne kadar araştırılmamıştır. Bu proje önerisinde (ilk kez olarak) kisspeptin nöronlarının farmakolojik ve farmakogenetik kronik modülasyonu ile LH sekresyonu azaltılarak olası yararlı etkiler araştırılacaktır. Kisspeptin-GPR54 sisteminin transgenik fare AH modelinde doğrudan nöron koruyucu ve β-amyloid oluşumunu engelleyici etkilerinin olup olmadığı da yine ilk defa olarak bu çalışmada optogenetik ve farmakogenetik yöntemlerle incelenecektir.
Kisspeptin-GPR54 sisteminin AH’daki rolünün araştırılması amacıyla bu proje önerisinde iki adet transgenik dişi fare modeli kullanılacaktır. İlk olarak, Kiss-Cre farelerde floresan GFP geni taşıyan virus kullanılarak işaretlenen kisspeptin nöron projeksiyonları konfokal mikroskobuyla değerlendirilecektir. Benzer metodoloji Kiss-Cre x Tg2576 çifte transgenik fare modelinde de tekrarlanarak bu nöronların projeksiyonlarındaki olası değişiklikler incelenecektir. Analizler, AH fenotipi oluşmadan önce (3 aylık farelerde) ve sonra (6. aydan sonra) gerçekleştirilecektir. Ayrıca aynı gruplarda GPR54 kisspeptin reseptörlerinin dağılımı da hipokampüs, hipotalamus ve kortekste immunohistokimyasal (IHC) metotla incelenecektir. İkinci olarak kisspeptin-cre fareler alınacak ve Tg2675 AH fareleriyle çaprazlanarak çifte transgenik fareler elde edilecektir. Bu farelerde (7 aylık) kisspeptin nöronlarının optogenetik yöntemle akut eksitasyon ve inhibisyonunun AH’da kognitif fonksiyonu (Morris Water Maze, MWM) nasıl etkileyeceği; farmakogenetik yöntemle kisspeptin-GPR54 sisteminin kronik eksitasyon ve inhibisyonunun kognitif davranış (MWM), katekolaminerjik ve kolinerjik nörotransmisyon ve AH nöropatolojileri üzerindeki olası rolü araştırılacaktır. Ayrıca, Tg2576 + kisspeptin-cre fareler de ovarektomi uygulanarak optogenetik ve farmakogenetik nöronal manipülasyonlar sırasında östrojenin kisspeptin-GPR54 sistemini nasıl modüle edebileceği, steroid hormon replasmanı yapıldığında etkilerin geri dönüşümlü olup olmayacağı da incelenecektir. Manipülasyonlardan önce kuyruk veninden ve dekapitasyondan sonra da kan örnekleri alınacaktır. Deneylerin sonunda beyin dokuları çıkartılarak dondurulacak ve hipokampus, korteks ve hipotalamus bölgelerini içeren kesitler elde edilecektir. AH patofizyolojisinde görülen β-amiloid oluşumu, mikrogliyozis, astrositozis, sinaptik hasar (synapsin-1 ve sinaptofizin) ve oksidatif stres değişimleri koronal beyin kesitlerinde immunohistokimyasal (IHC) metotla gösterilecektir. Ayrıca, kisspeptin ve GPR54 reseptörünün beyin kesitlerinde lokalizasyonu ve protein seviyeleri (sırasıyla) IHC ve western blot yöntemlerle belirlenecektir. Farmakogenetik deneyler sırasında beyin mikrodiyalizi ile alınacak ekstraselüler sıvıda noradrenalin, dopamin ve asetil kolin düzeyleri yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve elektrokimyasal dedeksiyon (HPLC-ECD) ile analiz edilecektir. Serum LH ve E2 düzeyleri ELISA ile ölçümlenecektir
Sonuçta kisspeptin-GPR54 sisteminin in vivo AH modelinde LH sekresyonunu modüle ederek dolaylı etkileri ile doğrudan olası nöron koruyucu etkileri karşılaştırılacaktır. Bu deneylerin sonuçları AH’nın daha iyi anlaşılmasına ve yeni nöroendokrin tedavi stratejilerinin geliştirilmesine katkı sağlayabilecektir. Bu projeden elde edilecek veriler (kullanılacak teknolojik araştırma metotlarının da katkısıyla) yüksek etki faktörlü uluslararası hakemli dergilerde yayımlanabilecektir. Ayrıca, projede bursiyer olarak görev alacak yüksek lisans ve doktora öğrencileri optogenetik ve farmakogenetik gibi önemli araştırma teknolojilerini ve bilimsel çalışma prensiplerini öğrenebilecek ve ülkemizin yeni bilim insanı potansiyelinin gelişmesine katkı sağlanabilecektir.
